铸造钴铬合金含银抗菌涂层表面特性及抗菌性能研究.pdf

实用口腔医学杂志(J Pract Stomato1)2014 Sep，30(5： 铸造钴铬合金含银抗菌涂层表面特性及抗菌性能研究 梁锐英 李敬东 赵艳萍徐艳丽 吴文慧 孟贺 廖囡囡 I摘要】 目的：观察钴铬合金含银抗菌涂层的表面特征和抗菌性能。方法：利用真空等离子喷涂方式在铸造钴铬合金表面 制备含银抗菌涂层，通过扫描电镜、能谱分析和x射线衍射分析涂层的表面性能。以常规铸造的钴铬合金试件作为对照组， 含银抗菌涂层铸造钴铬合金为实验组，选用贴膜法和荧光显微镜分析法比较2组试件对变形链球菌和白色念珠菌的抗菌性 能和抗黏附性能。结果：涂层表面结构均匀致密，与基底材料间未见明显间隙，表层主要物相为Ag、Cr和少量Ag20、Cr20，。 抗菌结果显示，实验组2种菌的菌落数明显少于对照组菌落数(P<0．05)，细菌黏附性明显低于对照组。结论：涂银钴铬合 金涂层性能稳定，具有较好的抗菌性能和抗黏附性能。 【关键词】铸造合金；表面特性；抗菌性能；黏附 The surface structure and antibacterial property of Ag-containing coating on casting cobalt chromium alloy LIANG Ruiying ，LI Jingdong ，ZHAO Yanping ，XU Yanli ， Wenhui ，MENG He ，LIAO Nannan ．1． 063000 Tangshan，Department of Prosthodontics，College of Stomatology，Hebei United Unive~ity，China；2．De- partment of Oral and Maxillofacial Surgery，Tangshan Xiehe Hospital 【Abstract】0bjective：To study the surface structure and antibacterial property of Ag—containing coating(AgCC)on casting cobalt chromium alloy(Co—Cr)．Methods：Plasma spraying technique was adopted to prepare AgCC on Co·Cr．Scanning electron microsco- PY，energy dispersive analysis and X—ray diffraction analysis were used to evaluate the Surface properties．The antibacterial effects of AgCC against staphylococcus aureus and candida albicaru were examined by film attachment method．Fluorescence microscope was a— dopted to evaluate the bacteria adhesion property．Results：AgCC surface was uniform and compact，combined perfectly with sub- strate materia1．The content of the sHrface was mainly Ag，Cr and a small amount of Ag2 O and Cr2 03．The results of antibacterial as— say showed that on AgCC the number of bacterial colony was fewer(P<0．05)and bacterial adhesion was less than those on Co—Cr(P <0．05)．Conclusion：AgCC surface was stable and has antibacterial property． 【Key words】 Casting alloy；Suet'ace characteristic；Antibacterial property；Adhesion 中图分类号：R783．1文献标志码：A doi：10．3969／j．issn．1001—3733．2014．05．011 钴铬合金具有优良的性能及价格优势在口腔修复 领域应用普及。钴铬合金铸造支架是可摘义齿修复的 重要组成部分，也是口腔内链球菌、乳杆菌、放线菌等 多种条件致病菌容易沉积的位置，而且随着义齿的戴 用时间的延长，易发生微生态失衡进而造成基牙龋损， 软组织炎症等…。采用药物浸泡消毒解决这些问题， 会存在抗菌广谱、容易产生细菌耐药性、副作用等固有 的局限性，使其I 床应用受到较大的限制。银系无机 抗菌剂具有很好的生物安全性，是目前口腔临床材料 改性中比较理想的抗菌材料 j，克服了传统有机抗 基金项目：唐山市科学研究与发展计划项目(编号：1014020IA-4) 作者单位：063000唐山，河北联合大学口腔医学院口腔修复科(梁锐 英赵艳萍徐艳丽吴文慧孟贺廖囡囡)；唐山市协 和医院口腔外科(李敬东) 通讯作者：吴文慧0315．3721568 E—mail：wuwenhui120@126．com 菌剂抗菌广谱、易产生耐药性等缺点。我们采用等离 子喷涂方式制备钴铬合金含银抗菌涂层，研究其表面 特性及抗菌性能，以初步评价此改性方式的可行性。 1材料与方法 1．1 试件制备 精密铸造规格为15 mm×15 mm×2 mm的钴铬 合金(Bego，德国)试件22个，利用万能工具磨床将所 有试件切割成10 mm×10 mm×1 mm，其中16个试件 表面应用等离子喷涂的方法制作含银涂层，所用喷涂材 料为银粉和铬粉(由北京矿业研究院提供)，所占比例 (质量比)分别为3％和97％，其中lO个做表面性能研 究，另外6个作为体外抗菌性能检测的实验组，剩余6 个试件不做任何处理作为抗菌l生能检测的对照组。 1．2表面性能研究 实用口腔医学杂志(J Pract Stomato1)2014 Sep，30(5) 1．2．1 扫描电镜观察和能谱分析采用s．4800型场 发射扫描电子显微镜(Hitachi，13本)对涂层表面和断 面进行扫描电镜观察，同时用Noran7型x射线能谱分 析仪(Noran，美国)对涂层表面进行能谱分析。 1．2．2孔隙率测试利用BX41型金相显微镜(O- lympus，13本)，采用截面定向截取法测试涂层的孔隙 率。截面定向截取法是在带有“十”字刻度的目镜下 测定，以“十”字中心为参考点，连续移动约20个视场 宽度，测定并计算出移动范围内所有孔隙的总长度占 连续移动总长度的百分比，即为涂层的孔隙率。 1．2．3 x射线衍射分析采用晶体单色cu靶，管电 压为40 kV，管电流100 mA，扫描速度1。／min，扫描范 围3～80，利用x射线衍射仪(Rigakudmax，13本)分析 涂层的相结构。 1．3抗菌性能研究 本实验所用菌株为变形链球菌(S．mutans)标准菌 株ATCC25175、白色念珠菌(C．albicans)标准菌株 ATCC76615(河北联合大学生命科学院提供)，每个菌 株用3个试件作3组平行实验，实验组和对照组试件 均经高温高压消毒后备用。 1．3．1 抗菌率检测2种菌株经复苏培养确定为纯 培养物后配置菌悬液，取复苏菌株，24 h转接1次，连 续培养3代在无菌环境下打开培养皿，选取圆形单菌 落接种到5 ml液体培养基中，C．albicans在有氧37℃ 摇床中增菌24 h。S．mutans在兼性厌氧环境下37℃ 增菌48 h，根据比浊结果将2种菌液调整浓度至1× 10 CFU／ml，用移液器取201xl配好的菌液滴加于实验 组与对照组试件上，用干燥的无菌镊子夹取聚乙烯薄 膜(高温高压蒸汽灭菌后)盖在试件表面，要使菌液均 匀的覆盖于试件表面，菌液无溢出为准。将试件置于 灭菌锥形瓶内，S．mutans在37℃兼性厌氧菌氧条件 下培养48 h，C．albicans在需氧条件下培养24 h。然 后在各锥形瓶中加入5 ml PBS缓冲液后，置于振荡器 上震荡5 min，取10 l洗脱液滴加于TSA平板上，在 平板上均匀推开，S．mutans在37 qC兼性厌氧菌氧条 件下培养48 h，C．albicans在需氧条件下培养24 h，取 菌落数300以内的平板计数。以上实验重复3次取平 均值。 抗菌率=(对照组菌落数CFU-试验组菌落数 CFU)／对照组菌落数CFU×100％ 1．3．2抗黏附性能检测 取对照组与实验组试件各 2片，每种菌各一组。常规清洗，高温高压灭菌。将2 组试件分别浸于浓度为1×10 CFU／ml的菌悬液中， C．albicans在需氧条件下培养24 h，S．mutans在兼性 厌氧条件下培养48 h。将试件取出用PBS缓冲液冲 洗，去除表面未黏附或黏附不牢的细菌，然后在2．5％ 戊二醛溶液(4℃存放)中固定2～12 h；再用PBS缓 冲液进行冲洗，再置于1％的吖啶橙水溶液中，室温下 避光浸泡30 min。定色后将试件在无菌去离子水下冲 洗，除去多余未附着染料的干扰。染色完成后于30 min之内，将试件置于荧光显微镜下做定性分析。 2结果 2．1 表面性能 2．1．1 扫描电镜 肉眼观察涂层表面平整，厚薄均 匀，色泽一致，无斑点、脱皮，表面覆盖良好。电镜观察 发现涂层组织致密，喷涂金属粉末颗粒紧密的结合在 一起，有一定的粗糙度，表面有微米级的台阶和纹理， 但无裂纹(图1A)，高倍扫描电镜照片可见少量微小 的孑L隙，直径约为1～4 Ixm(图1B)。断面扫描结果显 示涂层和金属基底两者问无明显界线，涂层和基底层 结合良好(图1 C)。 A：涂层表面(×100)；B：涂层表面(×1 000)；C：截面(×1 000)；a：银铬涂层；b：钴铬涂层 图1 钴铬合金含银抗菌涂表面形态 A：(×100)；B：(×1 000)；C：Cross section(×1 000)；a：Silver chrome coating；b：Cobalt—chromium alloy substrate (SEM) (SEM) 实用口腔医学杂志(J Pract Stomato1)2014 Sep，30(5) 2．1．2能谱分析图2—3为能谱分析图片，可见铬 为涂层的主体结构，银散在分布于涂层中，分布比较均 匀，但也有团聚现象发生。 2．1．3孔隙率 用金相显微镜截面定向截取法测量 涂层的孔隙率，测定结果涂层孔隙率为3．62％，在正常 范围(1％一10％)之内 。 2．1．4 X射线衍射分析图4为涂层表面的物相结 果，从图中可知，涂层中的主要物相为Ag和Cr，其中 夹杂有少量Ag 0和Cr 0 。 2．2抗菌性能 钴铬合金表面含银抗菌涂层对C．albicans和 S．mutans的抗菌性能见表1。结果显示，2组问菌落数 C r K 有显著性差异，钴铬合金含银抗菌涂层对S．mutans的 抗菌率为89％，对C．albicans的抗菌率为92％。 图5为S．mutans和C．albicans在荧光显微镜下 观察到的细菌黏附情况，图中橙色亮点部分代表细菌 黏附区域，实验组橙色亮点明显少于对照组。 表l 实验组和对照组抗菌性能比较 Tab 1 The antibacterial prope~ies of silver coating 注：①与实验组比较P<0．05 图2涂层中银分布的能谱分析图 图3涂层中铬分布的能谱分析图 Fig 2 Spectrum analysis chart of silver Fig 3 Spectrum analysis chaa of chrome distribution distribution 20 40 60 8O 20，。 图4涂层X射线衍射图 Fig 4 X—ray diffraction of the coating A：涂层表面S．mut(1n$；B：钴铬合金表面S．mutans；C：涂层表面C．albicans；D：钴铬合金表面C．albican．s 图5涂层抗细菌黏附性能 (荧光显微镜，×400) A：S．mttt~tn$on coating surface：B：S．mutans on Co—Cr sHrfaee；C：e albicans on coating surface；D： albieans on Co—Cr snrfaee Fig 5 Anti—adhesion property of the silve coating (Fluorescence microscope，×400) 3讨论 通过涂层表面性能的检测，可直接观察涂层的微 观形貌以及涂层与基底材料之间的结合情况，从而可 以初步判断表面改性是否成功。本实验通过扫描电镜 观察钴铬合金含银抗菌涂层表面特征，结果显示，涂层 组织致密，表面有微米级的台阶和纹理，但无裂纹，断 面扫描结果显示涂层和金属基底之间未见明显界线， 涂层和基底层结合良好。 能谱分析可以在对样品进行形貌观察的同时，对 观察到的某区域或点进行成分分析，结果显示铬为涂 层的主体结构，银散在分布于涂层中，分布比较均匀， 但也偶见团聚现象发生。 孔隙率是热喷涂涂层的重要质量指标之一，可直 接影响到涂层的性能。涂层的孔隙率越小，则说明涂 层致密。本实验结果显示涂层孔隙率在正常范围内， O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O 8 7 6 5 4 3 2 1 ∞ c r'o0 ·640· 实用口腔医学杂志(J Pract Stomato1)2014 Sep，30(5) 保证了涂层致密程度。 银铬涂层中的主要物相为Ag和cr，还有少量 Ag O和Cr：0 。涂层中氧化物的出现说明在喷涂过程 中粉末发生了氧化现象，这是正常的。Ag和Ag 0是 涂层中能发挥抗菌作用的主要成分。金属铬无毒，化 学性质稳定，在材料的耐腐蚀中发挥重要的作用。 Cr 0 中的铬为三价，三价铬有维持哺乳动物正常生 理功能的作用，是人体必需的微量元素之一，而六价铬 毒性较大 J，本实验涂层中未测试出六价铬的存在。 提示该涂层不存在毒性成分。 通过表面性能的研究，证实了该涂层结构致密，未 发现有毒成分存在，为进一步证实该涂层是否能否达 到预期的抗菌效果，又对其抗菌性能进行了初步的验 证为其临床应用提供更可靠的依据。 C．albicans在口腔中的存在是发生义齿性口炎的 重要影响因素 J，而S．mutans是口内最常见的致龋 菌 J。正常情况下唾液对口腔黏膜起到湿润及冲刷 等作用，使细菌难以在口内沉积。但随着义齿在口腔 内的戴用，口腔微环境发生变化，义齿区供氧条件及氧 化还原值电势发生变化，口腔生理自洁作用降低，在义 齿承托区黏膜与基托组织面之间形成新的滞留区，在 这个相对封闭的区域氧含量降低，唾液冲刷作用减少 等一系列变化为微生物黏附提供有利条件。因此通过 材料的改性提高义齿的抗菌性能显得尤为必要。 本实验通过对义齿修复常用的钴铬合金表面制备 含银抗菌涂层，观察其对C．albicans和S．mutans的抑 制作用。结果提示钴铬合金含银抗菌涂层对S．nit tans的抗菌率为89嚆，对C．albicans的抗菌率为92％。 细菌的黏附性能在其致病中发挥着重要的作用， 该实验通过抗黏附性能检测，发现对照组表面呈现了 大量的细菌黏附，细菌黏附呈团片状或线状分布。 S．mutans在对照组试件表面的黏附几乎遍布了整个视 野，黏附在对照组的细菌明显多于实验组。C．albicans 在对照组试件表面的黏附居多，菌落层叠遍布表面，而 实验组的菌落分布明显减少。 显然，银涂层在提高抗菌性和抗黏附性方面发挥 重要作用，可能是通过抑制细菌蛋白质的合成或者是 影响其DNA的复制来发挥作用 ，但其真正抗菌 机制还有待于进一步深入研究。 本实验结果初步证实，通过等离子喷涂方式在钴 铬合金表面喷涂含银抗菌剂，可获得结构均匀致密、性 能稳定的涂层。该涂层对C．albicans和S．mutans具有 明显的抗菌性能和抗黏附性能。 参考文献 [1]巢永烈，陈吉华，朱智敏，等．口腔修复学[M]．北京： 人民卫生出版社，201I：100． [2]Zhao L，Wang H，Huo K，et a1．Antibacterial nano—struc— tured titania coating incorporated with silver nanoparticles [J]．Biomaterials，201l，32(24)：5706—5716． [3] Monica F，Sergio P，Marta M，et a1．Silver nanoeluster—sili— ca composite coatings with antibacterial prope~ies[J]．Ma— ter Chem Phys，2010，120：123—126． [4] 于惠博，孙宏飞，武彬，等．降低涂层孔隙率的研究进 展[J]．材料导报，2007，21(1)：68—71． [5]王永芳．铬与健康研究进展[J]．中国食品卫生杂志， 2001，13(1)：45—47． [6]Pusateri CR，Monaco EA，Edgerton M．Sensitivity of Candi— da albicans biofilm cells grown on denture acrylic to antifun— gal proteins and chlorhexidine[J]．Arch Oral Biol，2009， 54(6)：588—594． [7]Daniluk T，Fiedoruk K，Sciepuk M，et a1．Aerobic bacteria in the oral cavity of patients with removable dentures[J]． Adv Med Sci，2006，51 Suppl 1：86—90． [8]Loyola—Rodriguez JP，Martinez—Martinez RE，Flores-Ferrey— ra BI，et a1．Distribution of Streptococcus mutans and Strep— tococcus sobrinus in saliva of Mexican preschool caries·free and caries-active children by microbial and molecular (PCR)assays[J]．J Clin Pediatr Dent，2008，32(2)：121 —126． [9] Espinosa．Crist6bal LF，Martinez．Castafi6n GA，T611ez．D6etor EJ，et a1．Adherence inhibition of Streptococcus mutans on dental enamel suYface using silver nanoparticles[J]．Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2013，33(4)：2197—2202． [10]Hern6ndez—Sierra JF，Ruiz F，Pena DC，et a1．The antimi— crobial sensitivity of Streptococcus mutans to nanoparticles of silver，zinc oxide，and gold[J]．Nanomedicine，2008，4 (3)：237—240． [11]Imazato S，Kinomoto Y，Tarumi H，et a1．Antibacterial ac— tivity and bonding characteristics of an adhesive resin contai— ning antibacterial monomer MDPB[J]．Dent Mater，2003， 19(4)：313—319． (收稿：2013-09—25修回：2013—11—18)